Las diferencias entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas incluyen el grosor de la pared celular, que tiene un grosor de aproximadamente 20 a 30 nanómetros en Gram positiva y de 8 a 12 nanómetros en Gram negativa; la cantidad de peptidoglicano en las paredes celulares; y el contenido de lípidos y lipoproteínas, que es bajo en bacterias Gram positivas y alto en Gram negativas. Usando el proceso de tinción de Gram, las bacterias Gram positivas dan un tono púrpura, mientras que las gramnegativas dan un color rosa.
Todas las bacterias contienen una capa de peptidoglicano en su pared celular, pero la diferencia entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas es que las Gram negativas tienen una capa delgada de peptidoglicano ubicada entre dos capas lipídicas. Esto es lo que le da a las bacterias Gram positivas una mancha rosa o roja en el proceso de tinción de Gram. Las bacterias gram positivas, por otro lado, producen un tono violeta o púrpura debido a la gruesa capa de peptidoglicano que se encuentra en sus paredes celulares. El proceso de tinción de Gram, descubierto por Hans Christian Gram, ayuda a identificar las bacterias.
Otra diferencia entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas se encuentra en la estructura de los flagelos, ya que Gram positiva contiene dos anillos en el cuerpo basal y Gram negativa que contiene cuatro anillos en el cuerpo basal. Las bacterias Gram positivas tienen una alta susceptibilidad a los tratamientos con penicilina y sulfonamida, mientras que las bacterias Gram negativas tienen una baja susceptibilidad.