Algunas ciudades importantes en un mapa del río Ohio son Pittsburgh, Pennsylvania; Cincinnati, Ohio; Louisville, Kentucky; Huntington, Virginia Occidental; y Evansville, Indiana. Otros lugares notables a lo largo del río Ohio son las ciudades de Parkersburg, Wheeling y Weirton, en Virginia Occidental, así como la ciudad de Owensboro, en Kentucky.
El río Ohio comienza en Pittsburgh. Desde allí, el río fluye hacia el norte por las ciudades de Sewickley, Coraopolis, Ambridge y Aliquippa en Pensilvania. En la ciudad de Rochester, el río Ohio gira hacia el oeste. Luego, el río pasa por las ciudades de Beaver y Midland antes de llegar a la frontera de Pensilvania con el estado de Ohio.
Al pasar por la ciudad de East Liverpool, Ohio, el río gira hacia el sur. La ruta del río define la frontera de Ohio con West Virginia. Las ciudades en el lado de Ohio del río incluyen Steubenville, Martins Ferry, Marietta y Gallipolis. Las ciudades en el lado del río de West Virginia incluyen Wheeling, New Martinsville, Parkersburg, Point Pleasant y Huntington.
Alrededor de la ciudad de Ironton, en Ohio, el río Ohio comienza a definir la frontera entre los estados de Ohio y Kentucky. Algunas ciudades de Kentucky que cruzan la frontera de Ohio incluyen Ashland, Vanceburg, Maysville, Brooksville y Newport. Después de que el río pasa por Cincinnati, el río comienza a definir la frontera de Kentucky con Indiana. Después de pasar la ciudad de Mount Wilson en Indiana, el río Ohio define la frontera de Kentucky con Illinois. El río Ohio desemboca en el río Mississippi en Cairo, Illinois.
